人类皮肤如何消除衰老细胞？
衰老细胞通常只能被先天免疫系统清除，当衰老细胞的数量达到一定程度，超过了免疫系统清除的能力，就会出现衰老细胞的累积。它们积极与周围环境交流，并通过多种分泌分子影响组织微环境，包括促炎细胞因子和组织重塑因子，统称为衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype，SASP）。因此，衰老细胞会助长组织中的慢性炎症状态，导致癌症和衰老相关退行性疾病的发展。考虑到衰老细胞会产生SASP，可以将细胞免疫表型标记为免疫系统监测和清除的潜在靶点。
2023年3月30日，麻省总医院癌症免疫学和皮肤生物学研究中心Shadmehr Demehri博士在Cell 期刊发表文章“Cytotoxic CD4+ T cells eliminate senescent cells by targeting cytomegalovirus antigen”， 研究者探索人类衰老细胞清除的机制，发现了一种以前未被识别的病毒组免疫轴，它可以防止衰老细胞在衰老皮肤中的积聚。
作者简介
Shadmehr Demehri 麻省总医院/哈佛医学院副教授，主要从事与皮肤癌、乳腺癌相关的癌症免疫预防领域的基础科学和转化研究。研究重点是确定免疫系统在维持正常组织稳态和预防癌症早期发展中的作用，以利用其抗肿瘤潜力进行癌症治疗和预防。
Research Highlights
研究亮点
1. 年老皮肤中衰老的成纤维细胞高表达HLA-II及HCMV gB抗原；
2. CD4 CTL以HLA-II依赖的方式特异性清除HCMV gB+的衰老成纤维细胞；
3. 人类免疫系统在进化中与 HCMV 建立共生关系，防止衰老细胞的积累。
Research Summary
研究总结
衰老细胞的积累与衰老相关疾病的发病机制有关。阻止衰老细胞在衰老的人体器官中积累的机制尚不清楚。本研究中，研究者证明了病毒-免疫轴控制人类皮肤中衰老的成纤维细胞积累。与年轻皮肤相比，年老皮肤中的衰老细胞数量与年龄增长（15~75岁）呈正相关。在年老皮肤中，衰老细胞的数量与年龄增长（50~75岁）不存在相关性，衰老细胞数量并未随年龄发生显著的变化。年老皮肤中衰老的成纤维细胞高表达HLA-II及HCMV-gB，CD4+细胞毒性T细胞可通过靶向该抗原清除衰老细胞。趋化因子CXC配体9（C-X-C motif chemokine 9，CXCL9）和细胞毒性 CD4+ T 细胞（cytotoxic CD4+ T cells，CD4 CTLs）募集的增加与老年皮肤中衰老成纤维细胞的减少显著相关。衰老的成纤维细胞表达人类白细胞抗原II类（human leukocyte antigen class II，HLA-II）和人类巨细胞病毒糖蛋白B（human cytomegalovirus glycoprotein B，HCMV gB），成为CD4 CTL的直接靶点。HCMV 在衰老细胞中重新活化，皮肤驻留T细胞以依赖HLA-II的方式清除衰老成纤维细胞。
Research Sample
研究样本
本研究中的正常成人人体皮肤样本来自美国马萨诸塞州总医院。研究者筛选了来自不同年龄和解剖部位的800多个人类皮肤样本，使用的皮肤组织样本包括年轻皮肤（n = 23，年龄范围：16-28 岁，平均年龄：23.1 岁）和老年皮肤（n = 31，年龄范围：53-74 岁，平均年龄：62.1 岁）。
Research Technology
研究技术
· 分离、培养人真皮成纤维细胞
· 人皮肤免疫细胞分离
· 皮肤分离细胞与衰老成纤维细胞共培养
· 皮肤样本的单细胞RNA测序
· 皮肤样本的TCR测序
Research Contents
研究内容
1、老年人皮肤中的衰老细胞增多
研究者筛选了来自不同年龄和解剖部位的800多个人类皮肤样本，最终选择23例年轻以及31例年老女性皮肤样本，通过衰老标志物p16INK4a对皮肤样本进行染色以确定衰老细胞。研究发现随年龄增长，表皮和真皮中p16INK4a+细胞数量显著增加，其中真皮层增加幅度更明显（图1 A-C）。老年人真皮p16INK4a+波形蛋白+成纤维细胞的数量较年轻人显著增多（图1D-E）。在年轻和老年皮肤样本中，真皮衰老细胞的数量与年龄呈正相关（p<0.0001）（图1F）。然而，在老年皮肤队列中，真皮衰老细胞的数量与年龄的增长没有任何显著相关性（p=0.2520）（图1G）。这一结果表明，除了年龄增加之外，其他生物因素可能控制老年人衰老细胞的积累。
图1
2、CD4 CTLs是人类皮肤中主要的细胞毒性淋巴细胞
为了确定调节老年皮肤中衰老细胞积聚的因素，研究者检查了表皮条件、血液或淋巴管密度是否影响衰老细胞数量。皮肤免疫细胞图谱显示，几种先天和适应性免疫细胞类型在老年真皮中高度富集（图2A）。其中，以穿孔素蛋白表达为标志的CD4 CTLs的数量与老年皮肤样本中真皮衰老细胞的数量呈负相关（图2B）。与年轻真皮相比，老年真皮中穿孔素+CD4 CTLs的数量显著增加（图2C-D）。在老年皮肤样本中，83.7%表达穿孔素蛋白的真皮细胞是CD4+T细胞（图2E），这表明CD4 CTLs是负责老年人皮肤免疫监测的主要细胞毒性淋巴细胞。为了确定在老年皮肤中募集CD4 CTLs的因素，研究者对年轻和老年皮肤样本进行RNA-seq。重点研究CXCL9趋化因子，它是CD4 CTLs上表达人CXC趋化因子受体3 （human chemokine C-X-C-motif receptor 3，CXCR3）的配体（图2G）。结果显示，与CXCL9low组相比，CXCL9high组皮肤中含有更高比例的CD4 CTLs和更低比例的衰老细胞（图2H-I）。这些结果表明，表皮细胞分泌的CXCL9可以招募CD4 CTLs清除皮肤真皮部位的衰老细胞。
图2
3、CD4 CTLs直接靶向衰老成纤维细胞
为了探究CD4 CTLs能否靶向衰老成纤维细胞而直接清除衰老细胞，研究者构建了体外衰老模型-连续传代诱导的复制性衰老，以衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase，SA-β-Gal）染色作为衰老成纤维细胞检测的指标（图3 A）。HLA-II的表达对于CD4 CTLs发挥免疫功能至关重要。研究发现HLA-II在衰老成纤维细胞上高度表达，而在正常成纤维细胞中的表达可忽略不计（图3E-F）。研究者将正常和复制诱导的衰老成纤维细胞与从老年人皮肤中分离的免疫细胞共同培养。结果显示，与正常成纤维细胞相比，皮肤自体提取的T细胞可有效杀伤诱导衰老的成纤维细胞，加入人类白细胞抗原DR （human leukocyte antigen DR，HLA-DR）抗体可阻断皮肤T细胞诱导的衰老成纤维细胞凋亡（图3I-K）。这些结果支持CD4 CTLs清除衰老细胞依赖于HLA-II的存在。
图3
4、HCMV DNA和RNA表达在衰老皮肤中上调
正常人类皮肤中可检测到人巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV） DNA和RNA，与年轻皮肤样本相比，老年人的水平显著增加（图4A–D）。HCMV RNA表达在老年皮肤的真皮成纤维细胞中明显增加（图4E）。研究者在67.7%的老年和43.5%的年轻皮肤样本中检测到HCMV阳性真皮细胞，这与美国人群中老年和年轻人的血清阳性率一致（图4F-G）。同时泛HCMV抗原阳性的皮肤样本具有更高水平的HCMV DNA表达（图4H）。
图4
5、衰老成纤维细胞表达HCMV gB抗原
研究发现衰老的成纤维细胞在人类皮肤中表达HCMV gB，与年轻皮肤相比，老年皮肤中HCMV gB+衰老成纤维细胞的数量显著增加（图5A-B）。与体内研究结果一致，复制和紫外线A诱导的衰老成纤维细胞在体外高度上调HCMV DNA和HCMV gB的表达（图5C-G）。HCMV感染会导致早期细胞内体的积累， HCMV在衰老的成纤维细胞中被激活，HCMV gB可以作为一种内源性抗原被HLA-II递呈（图6）。
图5
图6
6、HCMV gB抗原激活皮肤驻留的CD4 CTL细胞
TRBV6-5是CD4 CTL上主要表达的TCR上的片段，可以识别HLA-DR上的HCMV gB。对HLA-DR阳性的老年皮肤样本进行T细胞受体（T cell receptor，TCR）测序，发现在衰老皮肤中存在TRBV6-5 表达的T细胞克隆（图 7A）。为了进一步确定人类皮肤中HCMV gB特异性CD4 CTLs的存在，研究者用HLA肽四聚体对从年轻和老年人类皮肤中分离的T细胞进行染色，证明了人类皮肤中存在HCMV gB 特异性CD4 CTLs（图7B-C）。对HCMV抗原阳性的皮肤样本中的自体T细胞和成纤维细胞进行共培养，分析显示大多数凋亡的衰老成纤维细胞表达HCMV gB（图7D-E）。进一步探究HCMV对皮肤中的CD4+ T细胞的影响，HCMV促进CD4 CTL产生干扰素-γ（interferon -γ，INF-γ）（图7 G-H）。这些结果表明特异性识别HCMV gB的CD4 CTLs能够清除年老皮肤中衰老的成纤维细胞。
图7
总结
Conclusion
该研究确定了老年人皮肤中衰老的成纤维细胞不会再随着年龄增长而增加的关键机制。CD4 CTLs以HLA-II依赖的方式特异性消除HCMV gB+衰老成纤维细胞。这些发现揭示了HCMV对机体有利的一面，可通过提高抗病毒免疫反应来清除衰老细胞，预防衰老和衰老相关疾病。
参考文献：
Tatsuya Hasegawa, Tomonori Oka, Heehwa G Son, Valeria S Oliver-García, Marjan Azin, Thomas M Eisenhaure, David J Lieb, Nir Hacohen, Shadmehr Demehri. Cytotoxic CD4+ T cells eliminate senescent cells by targeting cytomegalovirus antigen. Cell. 2023 Mar 30;186(7):1417-1431.e20.doi: 10.1016/j.cell.2023.02.033.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37001502/
作者｜徐燕萍
编辑｜周静
审核｜刘玮丽
文章来自：徐燕萍 邵逸夫医院抗衰老前沿
