“1+1＞2”，风疹病毒棘突蛋白（E1-E2）现身说法
在免疫诊断产品的开发中，研发人员会发现，两种抗原联合使用，有时候会收获意想不到的效果。比如，原料A的灵敏度较好，但是特异性不尽人意，而原料B刚好相反。这时，原料A和原料B混合使用，调试用量比例后，则有可能获得理想的灵敏度与特异性。当然，原料混合使用这种做法并不常见。一方面，使用两种抗原可能会增加成本，另一方面，多一种抗原就是多一个变量，带给产品CV更大的挑战。 当然，也存在例外。在重组蛋白中，两种或多种蛋白联合表达，蛋白质形成聚合物，以一个整体用于诊断试剂，效果往往较出色！ 下面，就以风疹病毒棘突蛋白（E1-E2）为例，现身说法，阐述其中缘由。
风疹病毒的发现及检测首先，先介绍主角——风疹病毒（Rubella virus，RV）。 在18世纪中叶，由风疹病毒引起的风疹首次被两名德国医生发现。起初，风疹被认为是一种儿童轻度传染疾病。1941年，澳大利亚的眼科医生Norman McAlister Gregg注意到，患有先天性白内障的婴儿也患有先天性心脏病。这些婴儿的大多数母亲在怀孕的头三个月就感染了风疹。他首次将风疹的发生与婴儿的遗传缺陷相关联。后来，其他科学家也观察到类似情况。 经过科学家多年的潜心研究，现在我们知道，如果怀孕的母亲在怀孕的前20周内感染风疹病毒，病毒会通过胎盘屏障，进而感染胎儿，可能导致流产。风疹感染最严重的影响是其先天性致畸性，包括失明、耳聋、先天性心脏病、智力低下和神经系统并发症，所有这些统称为统称先天性风疹综合症（Congenital rubella syndrome，CRS）。 据WHO统计，全世界每年有超过100000名先天性风疹综合症婴儿出生。 由于CRS的严重危害性，很多国家/地区出台相关政策，以图消除风疹病毒感染带来的影响。其中，孕前筛查就是预防工作的重要一环。（1）中国，《孕前TORCH 筛查专家共识（2019版）》明确：同时检测血清特异性IgG和IgM，判断感染状态。如果孕前血清IgG 水平<10-15 IU/mL，则孕期不足以抵抗风疹病毒对胎儿的影响。 （2）WHO，《Manual for the laboratory diagnosis of measles and rubella virus infection》提出：大约50%的风疹病毒感染是亚临床，症状轻微，需要通过检测手段才能确认。急性期与恢复期双份血清特异性IgG的抗体滴度4倍升高，可确诊感染。特异性IgM检测最常用于判断近期感染。 （3）美国CDC，《Prevention of Measles, Rubella, Congenital Rubella Syndrome, and Mumps,2013: Summary Recommendations of the Advisory Committee on ImmunizationPractices (ACIP)》指出：收集血清的最佳时间点是在症状（发烧和出疹子）发作后第五天，特异性IgM的检测可以提供当前或最近的风疹病毒感染的推测证据。考虑IgM检测出现假阳性的风险，用特异性IgG亲和力检测作为辅助，判断近期感染或既往感染。 小结：风疹病毒感染的危害较严重，而孕前筛查可以有效降低其影响。免疫检测作为常规有效的实验室检测手段，已被世界各地推举且已应用到具体的预防工作中。具体的，特异性IgG和IgM联合检测可以作为感染状态的判断依据。IgG抗体亲和力是血清学检测的有效补充。当然，预防效果依赖于免疫检测结果的准确性。在技术层面，选择风疹病毒的哪种蛋白，可以最大限度保证诊断试剂的高性能呢？接下来，我们从蛋白质组学角度聊聊风疹病毒。
风疹病毒的蛋白质组学风疹病毒是一种正义单链RNA病毒，呈球形，约40-80nm，基因组约9.7 kb。风疹病毒仅编码5种蛋白质，如图1。其基因组由两个非重叠ORF组成，5’ORF表达非结构蛋白，3’ORF表达结构蛋白。
其中，结构蛋白有3种，包括：E1（58 kDa）、E2（42-47 kDa）和核衣壳蛋白C（33 kDa）。E1和E2是引起宿主免疫应答的主要靶抗原。有研究表明，核衣壳蛋白C与人体内的髓磷脂碱性蛋白的序列相似，在体外诊断中可引起交叉反应。因此，在风疹病毒的诊断原料选择中，常常把重心放在E1和E2上。风疹病毒E1和E2属于糖蛋白。在微观结构中，E1和E2是以异二聚体形式存在，从病毒突出形成6-8 nm的表面尖峰。两者的相对位置是，E1构型扩展且在棘突复合体的底部带有E2，E1分子更多地暴露在E2的表面上。如图2，风疹病毒的表面特征是倾向于形成四到六行平行的糖蛋白组。在拉长的病毒体中（图2A），糖蛋白行以螺旋模式缠绕在病毒体周围，终止于病毒体末端附近。这些糖蛋白结合并形成一个封闭的外壳。 概括讲，在风疹病毒体上E1与E2结合，以多聚体形式存在，两者在空间上有较紧密的联系。
我们知道，同一个蛋白质，以单独形式存在和以聚合物形式存在，两种蛋白构象是有差异的。蛋白质的空间构象改变，会导致一部分抗原表位消失，同时也会产生一些新的抗原表位。E1和E2以单独形式存在时，其提供的抗原表位种类，肯定部分不同于E1-E2异二聚体。 风疹病毒的E1和E2以异二聚体的形式存在。在免疫应答中，E1-E2异二聚体是作为一个整体被抗原提呈细胞溶解、呈递，诱导产生特异性抗体。因为抗原表位差异，E1-E2异二聚体诱导所产生的抗体中，有部分是E1或E2单体所不能识别。 因抗原表位不同而带来的检测偏差，有可能影响临床判断，诸如IgM抗体检测、IgG抗体亲和力检测等。因此，在风疹病毒抗体检测中，使用E1-E2异二聚体最为包被原，最大程度提供正确的抗原表位，是非常有必要的。 此外，有研究表明，E1与E2蛋白诱导免疫应答产生IgG的时间不完全重合。如图3。因此，可同时使用E1和E2用于免疫诊断，提高检测的灵敏度。
小结： 风疹病毒的E1和E2蛋白是激发机体产生免疫应答的主要蛋白。在天然病毒体中，E1和E2相互作用以异二聚体的形式存在，共同诱导机体产生抗体。同一个蛋白质，以单独形式存在和以异二聚体形式存在，两种蛋白构象是有差异，提供的抗原表位也不同。因此，E1-E2异二聚体诱导所产生的抗体中，有部分是E1或E2单体所不能识别。此外，衣壳蛋白C因为与髓磷脂碱性蛋白的同源性，存在交叉反应的风险，因此较少用于临床诊断。 总结： 风疹病毒的抗体检测是孕前筛查、预防先天性风疹综合症的重要一环。因为风疹病毒核衣壳蛋白C与人体髓磷脂碱性蛋白存在同源性，因此在临床诊断中，天然全抗原或核衣壳蛋白C存在交叉反应的风险，并非理想选择。 E1和E2是刺激机体产生免疫应答的主要蛋白，因此是检测抗体的主要原料。如上所述，蛋白构象不同导致抗原表位差异。风疹病毒的E1和E2是以异二聚体形式存在，其刺激人体产生的抗体，可能部分不能与E1或E2单体特异性结合。而重组蛋白E1-E2异二聚体经表达系统修饰，可以最大限度还原蛋白构象，提供正确且丰富的抗原表位，确保检测结果的准确性。 E1-E2异二聚体用于检测试剂，可以有效加成E1和E2单体的特异性抗体。同时蛋白构象更加接近天然，是E1和E2单体所不具备。因此说，E1-E2异二聚体可以实现“1+1＞2”的效果。
SERION 风疹病毒抗原（E1-E2）维润赛润推出风疹病毒棘突蛋白（E1-E2），采用昆虫表达系统，以满足糖基化修饰要求。蛋白以E1-E2异二聚体的形式存在，接近天然状态的蛋白构象，提供正确且丰富的抗原表位，可有效提高检测试剂的性能！ 产品：Rubella Spike Ectodomain (E1-E2)货号：BA129R01 产品咨询：Virion\Serion 原料事业部18818686988 / 0755-89381139 参考文献：
[1] Laboratory Diagnosis of Rubella Infections.
[2] Diagnosis of rubella infection by detecting specific immunoglobulin M antibodies in saliva samples: a clinic-based study in Niterói, RJ, Brazil.
[3] Rubella: Diagnosis and Tests.
[4] Rubella infection: Advances and challenges in the diagnosis and prevention of Congenital Rubella Syndrome.
